bioworlde  Ni-IDA 瓊脂糖 6B

bioworlde  Ni-IDA 瓊脂糖 6B

Ni-IDA 瓊脂糖凝膠 6B BD0052-2

產(chǎn)品名稱：
Ni-IDA Sepharose 6B

應(yīng)用：
Biogot TM Ni-IDA sepharose 6B 比其他 Ni-IDA 固定了更多的 Ni2+（看起來(lái)更藍(lán)）。我們的 Ni-IDA 每毫升可以偶聯(lián)更多的蛋白質(zhì)。我們的產(chǎn)品由 GE Sepharose CL 凝膠制成。Sepharose 的交聯(lián)形式在化學(xué)和物理上比 Sepharose 本身更具耐受性，提供相同的選擇性和更好的流動(dòng)特性。交聯(lián) Sepharose 凝膠對(duì)有機(jī)溶劑具有耐受性，因此是在有機(jī)溶劑中分離的選擇

背景：
通過(guò)固定化金屬親和層析 (IMAC) 純化組氨酸標(biāo)記的重組蛋白越來(lái)越受歡迎。鎳 (Ni2+) 是 IMAC 純化中常用的金屬離子。Ni-IDA Sepharose 6B 由 90 μm 高度交聯(lián)的瓊脂糖珠組成，其中固定有螯合配體。然后該螯合基團(tuán)帶有鎳 (Ni2+) 離子。與其他鎳親和層析相比，Ni-IDA 具有更高的蛋白結(jié)合能力。它具有低 Ni2+ 泄漏，并與蛋白質(zhì)純化中使用的各種添加劑兼容。其高流量特性使其非常適合放大和重力流柱純化。

備用名稱 ：
推薦的緩沖液：非變性條件：結(jié)合/洗滌緩沖液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脫緩沖液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。變性條件：結(jié)合/洗滌緩沖液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脫緩沖液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。注意：為獲得很佳純度和產(chǎn)量，樣品和緩沖液中所需的咪唑很佳濃度因蛋白質(zhì)而異。在非變性條件下，結(jié)合緩沖液中的 20-40 mM 咪唑適用于許多蛋白質(zhì)。洗脫緩沖液中的 500 mM 咪唑通常足以洗脫目標(biāo)蛋白。再生培養(yǎng)基 注意：如果要純化相同的蛋白質(zhì)，則不必在每次純化之間剝離介質(zhì)；根據(jù)細(xì)胞提取物體積、目標(biāo)蛋白等，在 5-7 次純化后重新填充培養(yǎng)基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。根據(jù)細(xì)胞提取物體積、目標(biāo)蛋白等，在 5-7 次純化后重新填充培養(yǎng)基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。根據(jù)細(xì)胞提取物體積、目標(biāo)蛋白等，在 5-7 次純化后重新填充培養(yǎng)基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。為 Ni-IDA Sepharose 6B 充電，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗滌。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。為 Ni-IDA Sepharose 6B 充電，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗滌。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌，然后再對(duì)柱進(jìn)行充電，以去除殘留的 EDTA。要對(duì)水洗柱進(jìn)行充電，請(qǐng)?jiān)谡麴s水中加載 0.5 個(gè)柱體積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體積的蒸餾水清洗，然后用 5 柱體積的結(jié)合緩沖液（以調(diào)節(jié) pH 值）清洗，然后儲(chǔ)存在 20% 乙醇中。

分類 :
蛋白質(zhì)相關(guān)試劑

形式：
液體

含量 :
6% 瓊脂糖

儲(chǔ)存和保質(zhì)期：
Ni-IDA Sepharose 6B 有 2、10、25 和 100 ml 實(shí)驗(yàn)室包裝可供選擇，以滿足不同的要求。培養(yǎng)基在 4°C 至 30°C 的 20% 乙醇中儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間。

程序 ：
樣品制備：以下方案已在我們的實(shí)驗(yàn)室中成功使用，但其他既定程序也可能適用。1. 用于在大腸桿菌或酵母細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的蛋白質(zhì)。稀釋細(xì)胞糊：每克細(xì)胞糊加入5-10 ml 結(jié)合緩沖液。樣品和結(jié)合緩沖液必須含有相同濃度的咪唑，以防止宿主細(xì)胞蛋白與暴露的組氨酸結(jié)合。同時(shí)，去除大顆粒和高濃度試劑，如 EDTA、氨基酸和還原劑，這會(huì)破壞 Ni-IDA 樹(shù)脂。2. 酶促裂解：0.2 mg/ml 溶菌酶、20 µg/ml DNAse、1 mM MgCl2、1 mM PMSF（終濃度）或其他蛋白酶抑制劑。抑制劑必須對(duì) Ni 樹(shù)脂的能力沒(méi)有影響。然后在 +4°C 下攪拌 30 分鐘。3. 機(jī)械裂解：超聲處理，均化、反復(fù)冷凍/解凍或類似技術(shù)。4. 將裂解物的 pH 值調(diào)節(jié)至 pH 7.4：請(qǐng)勿使用強(qiáng)堿或強(qiáng)酸調(diào)節(jié) pH 值（沉淀風(fēng)險(xiǎn)）。5. 離心裂解物：轉(zhuǎn)移到管中并在室溫或 +4°C 下以 12000rpm 離心 20 分鐘，具體取決于蛋白質(zhì)的敏感性。6. 收集上清液并進(jìn)行純化。7. 酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)分泌到培養(yǎng)基中的蛋白，如果上清液量大，用硫酸銨沉淀法濃縮蛋白，用1×PBS透析，然后上柱，如果是位培養(yǎng)上清液不含 EDTA、組氨酸或任何其他可能影響 Ni 柱的還原劑，可直接上樣到柱上。筆記：您也可以將未澄清的樣品應(yīng)用到色譜柱（即省略上面的第 5 步）。如果是這樣，稍微延長(zhǎng)機(jī)械裂解時(shí)間，例如超聲處理 10 分鐘。由于未澄清樣品的粘度較高，總純化時(shí)間將增加。純化程序： 1. 柱準(zhǔn)備。(a) 輕輕顛倒瓶子數(shù)次，使樹(shù)脂懸浮，以混合漿料。(b) 使用移液器將適當(dāng)體積的 Ni 樹(shù)脂漿液轉(zhuǎn)移到柱中。讓樹(shù)脂沉降，讓存儲(chǔ)緩沖液從柱子中流出。(c) 用四床體積的結(jié)合/洗滌緩沖液平衡柱子或直到 A280 穩(wěn)定。2. 純化蛋白質(zhì) (a) 將蛋白質(zhì)結(jié)合到樹(shù)脂上。將上述含有 His 標(biāo)記蛋白的可溶性澄清樣品以每分鐘 0.5-1 毫升的流速應(yīng)用于柱子。收集并保存流經(jīng)以供分析。(b) 洗滌。用八床體積的結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子或直到 A280 在每分鐘 1 毫升的流速下穩(wěn)定。(c) 目標(biāo)蛋白的洗脫。用五到十床體積的洗脫緩沖液洗脫多組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。根據(jù)目標(biāo)蛋白的具體應(yīng)用，收集洗脫物并在 20 mM Tris-HCl pH 8.0 或 1×PBS，pH 7.4 中透析。3. 在變性條件下從大腸桿菌中純化多組氨酸標(biāo)記蛋白（主要在包涵體中表達(dá)）： (a) 在 1× PBS 中重懸細(xì)胞沉淀（每 ml 沉淀約 5 ml），并通過(guò)超聲破碎細(xì)胞如上所述。(b) 將裂解物以 12,000 rpm 離心 10 分鐘，收集包涵體。必要時(shí)用 1× PBS 清洗包涵體數(shù)次。(c) 將包涵體溶解在結(jié)合/洗滌緩沖液中（每 ml 沉淀約 5 ml），并在室溫下孵育 30-60 分鐘。可能需要均質(zhì)化或超聲處理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鐘以去除任何殘留的不溶性物質(zhì)。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，不要干擾顆粒，并將其加載到用結(jié)合/洗滌緩沖液預(yù)平衡的 Ni 柱上。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。并在室溫下孵育 30-60 分鐘。可能需要均質(zhì)化或超聲處理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鐘以去除任何殘留的不溶性物質(zhì)。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，不要干擾顆粒，并將其加載到用結(jié)合/洗滌緩沖液預(yù)平衡的 Ni 柱上。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。并在室溫下孵育 30-60 分鐘。可能需要均質(zhì)化或超聲處理才能溶解沉淀。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鐘以去除任何殘留的不溶性物質(zhì)。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，不要干擾顆粒，并將其加載到用結(jié)合/洗滌緩沖液預(yù)平衡的 Ni 柱上。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。000 rpm 30 分鐘以去除任何殘留的不溶性物質(zhì)。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，不要干擾顆粒，并將其加載到用結(jié)合/洗滌緩沖液預(yù)平衡的 Ni 柱上。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。000 rpm 30 分鐘以去除任何殘留的不溶性物質(zhì)。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中，不要干擾顆粒，并將其加載到用結(jié)合/洗滌緩沖液預(yù)平衡的 Ni 柱上。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。(e) 用結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近于零。(f) 用很小體積的洗脫緩沖液洗脫。注意：此處推薦的過(guò)程是從包涵體中純化蛋白質(zhì)，此過(guò)程洗脫的蛋白質(zhì)可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質(zhì)。

研究用途：
僅供研究使用，不得用于診斷程序。

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